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影響Taq DNA聚合酶的四大因素

Taq DNA聚合酶是第yi個(gè)被發(fā)現(xiàn)的熱穩(wěn)定DNA聚合酶，分子量65kD，開始由Saiki等從溫泉中分離的一株水生噬熱桿菌（thermus aquaticus）中提取獲得。此酶能耐高溫，在70℃反應(yīng)2h后其殘留活性大于原來的90%，在93℃下反應(yīng)2h后其殘留活性是原來的60%，在95℃下反應(yīng)2h后其殘留活性是原來的40%；在分子克隆中Taq DNA聚合酶可用于DNA序列測定并可利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）對DNA的特定片段進(jìn)行體外擴(kuò)增。在PCR過程中，由于Taq DNA聚合酶在變性步驟中（約94℃）不失活，可直接進(jìn)入第二輪循環(huán)，因此不必每輪循環(huán)時(shí)重新加入新酶，這使得Taq DNA聚合酶成為PCR反應(yīng)中的*用酶。

（一）溫度：雖然Taq DNA聚合酶有很強(qiáng)的溫度適應(yīng)范圍，但高于60℃的環(huán)境仍會(huì)使部分酶變性失活。反之，如果溫度低于正常值，酶活性受到限制。而且由于引物在低溫下（特別是25—27℃）可能與基因組中別的部分同源序列結(jié)合，使得一些擴(kuò)增產(chǎn)物并非為目的序列。適當(dāng)提高溫度，錯(cuò)配堿基多會(huì)解離，反應(yīng)產(chǎn)物特異性增加。
（二）鎂離子濃度：Taq DNA聚合酶活性對Mg2+的濃度非常敏感。Taq DNA聚合酶和許多其他聚合酶一樣，是Mg2+依賴性酶。用鮭魚精DNA作模板，dNTP的總濃度為0.9~0.8mmol/L，用含不同濃潑MgCl2的PCR系統(tǒng)使反應(yīng)進(jìn)行10分鐘。測定結(jié)果表明：在MgCl2為2.0mmol/L條件下，酶活性顯示盈高。Mg2+濃度偏高，酶活性會(huì)受到限制，10mmol/LMgCl2使酶活性抑制約50%。由于Mg2+可以與負(fù)離子或負(fù)離子團(tuán)（如根）結(jié)合，而在PCR中，DNA模板、引物以及dNTP是根的主要來源，其中dNTP占有很大比例。因此反應(yīng)系統(tǒng)中，Mg2+的濃度還要受到dNTP濃度的影響，欲獲得反應(yīng)結(jié)果，要對反應(yīng)條件進(jìn)行必要的探索。每當(dāng)一個(gè)新的目的片段和引物第yi次使用時(shí)，或者某種參數(shù)（dNTP或引物濃度）改變時(shí)，應(yīng)進(jìn)行Mg2+的濃度滴定。一個(gè)普遍的原則是，樣品中Mg2+的濃度至少要比dNTP總濃度高0.5~1.0mmol/L。
（三）KCl的濃度：一般是50mmol/L，高于75mmol/L時(shí)，聚鏈反應(yīng)就受到明顯的限制。當(dāng)KCl濃度高達(dá)200mmol/L以上時(shí)，聚鏈反應(yīng)就受到明顯的限制，此時(shí)反應(yīng)進(jìn)行10分鐘仍無核苷摻入．濃度均為50mmol/L的NH4ClNH4Ac以及NaCl對TaqDNA聚合酶活性影響則分別為中等抑制、無影響以及25~30%促進(jìn)。
（四）dNTP的濃度：均衡的低濃度dNTP更有利于酶活性的發(fā)揮，并能減少錯(cuò)配，獲得多量的特異性強(qiáng)的DNA反應(yīng)產(chǎn)物。各種核苷酸濃度為40umol/L的100ulPCR系統(tǒng)可以得到2.6ugDNA產(chǎn)物，而只消耗所提供核苷酸的半量；
（五）幾種變性劑對酶活性的影響：10%乙醇尚不抑制酶活性；二甲基亞砜（DMSO），二甲替甲酰胺（DMF）。甲酰胺在低濃度時(shí)對酶活性無影響，隨著它們濃度的提高，酶活性明顯下降。l0%DMSO會(huì)使酶活性減半。然而另有研究者觀察到，在某些聚鏈反應(yīng)系統(tǒng)中，10%DMSO起著有利作用。這種結(jié)構(gòu)各異的現(xiàn)象還表現(xiàn)在用尿素進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中。1.0mol/L尿素能提高酶活性，2.0mol/L尿素能保存大部分酶活性。然而也有報(bào)告認(rèn)為0.5mol/L尿素則*抑制PCR?？傊?，變性劑對TaqDNA聚合酶以及PCR系統(tǒng)的影響參數(shù)有待更多的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。TaqDNA聚合酶對SDS十分敏感，而某些非離子型去污劑又能*消除低濃度SDS對酶活性的抑制效應(yīng)。例如，0.5%Twen20及0.5%NP40可抵銷0.01%SDS對酶活性的影響。